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        美寶胃腸膠囊維持胚胎小白鼠胃組織器官型植塊存活及促進細胞增殖

        2001年-11月-17日 來源:美寶國際集團
        美寶集團中心實驗室 徐榮祥,王運平,范然,王建虹,林海

        [摘要]:目的:通過體外檢測美寶胃腸膠囊(GIC)對胚胎小白鼠胃組織器官型植塊生長的影響以探索GIC修復胃腸道粘膜損傷的機理。方法:體外培養胚胎小白鼠胃器官型植塊,將植塊分為兩組:實驗組和對照組。結果:實驗組的胃器官型植塊能很好地維持存活,從其中長出的單個細胞以及細胞克隆生長好、生長時間長。而對照組的胃器官型植塊很快變性死亡。二者差異非常顯著。結論:GIC能維持胚胎小白鼠胃器官型植塊存活并促進來自植塊的細胞和細胞克隆的生長,并且此過程可能與GIC激活上皮干細胞有關。

        [關鍵詞]:GIC;胃植塊;生長

         

        GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Stomach of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

        Central laboratory, MEBO Global Group 100053

        [Abstract]Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on the lesion of gastrointestinal tract through testing the effect of GIC on survival and growth of organ-type explants of gastric tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of gastric tissue of mouse embryo in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants in test group could survive,single cells and cell clones from explants grew well and long. However, explants, cells and cell clones in control group died off after a short period of time. There was significant difference between two groups. Conclusion: MEBO could promote survival and growth of cells of gastric explants of mouse embryo and this process may be related to activation of epithelial stem cells.

        [Key words]: GIC; gastric explant; growth  

          本實驗的目的在于通過體外檢測GIC對胚胎小白鼠胃組織器官型植塊生長的影響以初步探討GIC治療粘膜損傷性疾病的機理。

         

          一. 儀器、設備、材料、試劑及實驗動物

          超凈工作臺(北京半導體設備二廠)、培養箱(美國Forma)、超級恒溫水浴及恒溫電烤箱(重慶四達)、冰箱(江蘇長嶺)、倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)、顯微成像分析系統(上??迫穑?、微波爐(廣東Galanz)、微型計算機(北京沐澤)、光學顯微鏡(江蘇光學儀器廠)、各種型號注射器、12孔培養板(丹麥NUNC)、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器(1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國Gilson)、大小滴頭、培養皿(φ5cm、φ6cm)、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、各種眼科手術器械、顯微外科器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC(本公司生產)、MEM培養基(美國Hyclone)、胎牛血清(杭州三利)、青霉素和鏈霉素(華北制藥)等。

          實驗動物:昆明種胚胎鼠。

         

          二. 實驗方法:

          1.取一只孕16日齡的昆明種雌性小白鼠,頸椎脫臼法處死,先置于75%乙醇中浸洗一遍(2分鐘),再置于75%乙醇中消毒5分鐘;

          2.用眼科剪以及止血鉗先剪開雌鼠的腹部皮膚,鈍性分離至兩側,充分暴露腹壁肌肉,然后小心剪開腹壁全層,切勿傷及內臟及小鼠胚胎;

          3.剪開子宮,從宮腔中取出胚胎鼠,置入無菌平皿中;

          4.用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次,每次1分鐘;

          5.用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開,再用顯微外科鑷子夾起鼠胃,自賁門及幽門部切斷,得到全胃,切掉并棄去近賁門的1/3,然后沿胃大彎處縱行切開鼠胃,充分暴露胃粘膜;

          6.用雙抗-冷PBS將胚胎鼠胃連續洗滌兩次,每次1分鐘;

          7.將鼠胃置于含雙抗的MEM培養液中浸洗2次,每次1分鐘;

          8.將鼠胃剪成極小的器官型植塊,面積約1mm×1mm;

          9.將植塊置于12孔培養板的培養孔中央,每孔5塊,間隔約2mm,布局合理,粘膜面向上,輕輕按壓每塊植塊,使其緊貼培養板的表面;

          10.沿培養孔的邊緣,緩慢加入約0.5ml的完全MEM培養液,勿使培養液與植塊接觸;

          11.將培養板置于37、5%培養箱中預孵育1小時;

          12.每孔加完全MEM培養液2ml,輕拿輕放,切勿使植塊飄起,實驗組加GIC;

          13. 實驗組和對照組同步等量換液,每次去掉原液的1/2左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養液;

          14.用倒置顯微鏡觀察植塊生長情況,用顯微成像記錄分析系統記錄所觀察的結果,并用計算機保存圖像。

         

          三.實驗結果

          細胞全程培養111天以內的報告:培養過程中未出現污染,實驗組和對照組的胃組織植塊剛開始培養時,能固定在培養孔中央,但隨著培養時間的延長,植塊先后慢慢脫離培養孔底部,游離飄浮于培養液中,但仍然貼近培養孔底部,并且大多集中于培養孔中央,植塊的大小和形狀幾乎沒有變化。這是培養前7天的情況。

          實驗組植塊和對照組植塊在培養的前7天,組織塊是完整的,但從培養的第8天開始,組織塊就開始逐漸松解,并最終成為肉眼不易察覺的組織塊,同時在實驗組和對照組的視野中出現了單個細胞以及細胞克隆,在體外培養的第18天,對照組中的單個細胞以及細胞克隆逐漸變黑、皺縮、死亡、硬結,而此時實驗組的細胞生長繼續呈現良好的生長態勢,單個細胞很多,在視野中到處可見,細胞類型大多為圓形或橢圓形,細胞核清晰,細胞是典型的活細胞,以培養孔中央數量最多,越靠近培養孔邊緣細胞越少,邊緣幾乎沒有,同時細胞克隆數也逐漸增多,每個克隆所含有的細胞個數也越來越多。這種明顯的差別在其它器官型植塊的培養中也曾經反復出現過,主要與營養物質供應有關。顏色變深往往是組織細胞變性壞死的前兆,說明單純的MEM培養基無法提供給組織塊合適而充足的營養,恰恰相反,GIC以其豐富的營養從一開始便能使組織處于一個與體內環境相差不大的生長環境中,充分保證了組織和細胞的活性。

          下面為實驗組和對照組的對比圖,從中可以看到差別是何等之明顯。

        圖1 培養第24天。圖1A為對照組,圖1B為實驗組。對照組中的胃組織細胞或細胞克隆已經死亡,實驗組中顯示的是細胞克隆。
        圖1A
        圖1B
        圖2 培養第30天。圖2A為對照組,圖2B為實驗組。對照組中殘留的是胃組織細胞碎片,實驗組中是一個細胞克隆。
        圖2A
        圖2B
        圖3 培養第38天,圖3A為對照組,圖3B為實驗組。對照組中殘留的是胃組織細胞碎片,實驗組中是一個細胞克隆,克隆中的細胞生長良好。
        圖3A
        圖3B
        圖4 培養第42天,圖4A為對照組,圖4B為實驗組。對照組中殘留的是胃組織細胞碎片以及細胞克隆碎片,實驗組中是細胞克隆。
        圖4A
        圖4B

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